国外植入前遗传学诊断指南解读

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  • 来源:广州试管婴儿

1990年全球首例植入前遗传学诊断(PGD)试管婴儿的出生标志着现代人类辅助生殖另外技术的突破性进展。近十年来,愈来愈单细胞全基因组扩增另外技术及分子遗传学诊断另外技术的讯速发展,植入前遗传学诊断另外技术采取讯速讯速发展及广泛应用。

  综合整理:《说全球实用妇科与产科杂志》

  文字作者:刘东云,黄国宁

  1990年全球首例植入前遗传学诊断(PGD)试管婴儿的出生标志着现代人类辅助生殖另外技术的突破性进展。近十年来,愈来愈单细胞全基因组扩增另外技术及分子遗传学诊断另外技术的讯速发展,植入前遗传学诊断另外技术采取讯速讯速发展及广泛应用。2008年PGD国际协会(PGDIS)公布的综合数据数据显示,可采取植入前遗传学诊断的单基因疾病种类约170种。目前来看全球国内尚永远存在植入前遗传学诊断另外技术规范,是为,文字作者以“consensus”or “guideline”, and “PGD” or “PGS”为重要词检索了2010年目前为止 的关于 全球国内植入前遗传学诊断另外技术规范或指南关于 文献,并就此解读。

  1、国际PGD指南概况

  已于已于组建于2002年10月的PGDIS 2004年颁布了PGD另外技术指南(PGDIS, 2004)。已于2008年修正了PGD操作多种不同方式流程及实验室质量既保证指南,就PGD实验室已建立、标本取材、诊断另外技术、胚胎移植、质量掌控与既保证、遗传咨询与随访等关于 指出好个人建议。欧洲现代人类生殖与胚胎协会(ESHRE)PGD顶级控卫就PGD实验室的设立及关于 的3项另外技术:DNA扩增另外技术、荧光原位杂交(FISH)另外技术、胚胎活检已建立了关于 指南。2015年,Tur-Kaspa等关于 指出好用于HLA配型的PGD指南,有助于指导PGD另外技术在去选择与罹患血液系统实现疾病、急需脐带血干细胞(骨髓)移植肿瘤患者的孩子去选择HLA配型符合的胎儿中有规范应用。成为高加索人群才是常见的单基因遗传病,囊性纤维瘤在欧洲人群中有患病率为1/4000,Girardet等2015年则关于 指出好囊性纤维瘤PGD指南,可成为单基因病PGD另外技术指南参考。是为的 指南有助于规范PGD另外技术,并已建立符合说全球国情的PGD另外技术规范和指南。

  2、PGD实验室已建立指南

  PGDIS个人建议应可以根据ESHRE Embryology Specail Interest Group 的推荐一 已建立合理的IVF实验室及高效的PGD实验室。PGD流过程另外 胚胎培养、胚胎活检、细胞固定、细胞DNA扩增、荧光原位杂交、基因测序、胚胎移植等诸多过程,各实验室应已建立充分的完整信息 交流,并遵循严格、一致的质量掌控标准中。另外实验室操作多种不同方式流程应记录另外 本操作多种不同方式手册上,实验室工作中人应及时更新操作多种不同方式手册,并既保证每每一位女性人人名学生关于 工作中人掌握最重新开始操作多种不同方式流程。依次还要既保证治疗方式纵使另外 致性。PGD变化变化过程,胚胎活检、胚胎的独立培养、可以根据PGD纵使去选择可移植胚胎是第三点 3个过程,须双人审核。PGD实验室应不少人 别的采取另外 FISH和聚合酶链反应程度(PCR)的单细胞遗传学分析结论与诊断另外技术。

  不少人极体活检、卵裂期胚胎活检和囊胚活检都可用于PGD,不少人PGD四大中心还须要经一正规培训的胚胎学工作中人熟练掌握并较较长时间操作多种不同方式不已达 另外技术,永远存在不已达 活检另外技术而但在每依次PGD四大中心都常规采取。PGD实验室已建立变化变化过程应格外应注意避免出现外源性细胞或DNA污染活检细胞,外源性DNA污染另外 综合整理于操作多种不同方式者纵使的污染等。严格遵循PCR实验室操作多种不同方式规范。基因扩增前的操作多种不同方式应在独立的区域且在超净工作中台下采取,PGD分析结论应能检测出母源性及父源性DNA污染的纵使性,如果永远存在较高的误诊风险。活检直到细胞应在相邻的独立区域采取细胞固定(用于FISH)或全基因组扩增(用于PCR)。标本的标记和识别是依次高风险过程,在细胞固定或转入PCR反应程度管时、胚胎诊断及诊断后对应胚胎这3个过程上还要经一双人审核与认证。全球全球国内也我的所有 为的 生殖四大中心将活检直到标本外送至特定的检测新公司或实验室采取诊断,此刻还但在生殖四大中心与检测实验室关系 已建立严格的标本运输与接收、标记体系,别的应指出你来我往权责。生殖四大中心和检测实验室关系 应就法律、保险和责任签署已于合同。个人建议生殖四大中心和检测实验室共同采取联合知情同意书。生殖四大中心采取的细胞固定或转入PCR反应程度管的操作多种不同方式不少人 采取检测实验室的纵使再获后方可施行临床标本检测。

  3、胚胎活检另外技术指南

  可用于PGD的细胞综合整理另外 卵子极体、卵裂期细胞、囊胚滋养外胚层细胞。不尽不尽相同综合整理的细胞可采取不尽不尽相同目纵使PGD,极体活检再就 用于检测卵子非整倍体及母源性遗传病,而是检测父源性遗传性疾病,目前来看全球国内另外而是生殖四大中心采用机械极体活检。卵裂期及囊胚细胞可用于另外所再就 数PGD。

  胚胎活检可采取机械法、化学法、激光法在透明带开孔。PGDIS个人建议只也能透明带上开依次孔,以避免出现细胞丢失或胚胎孵出时嵌顿于透明带开孔处。应避免出现开孔过大(>60μm)、过度挤压胚胎、激光能量过高,不已达 操作多种不同方式均纵使损伤胚胎。

  活检培养基采取与胚胎培养不尽相不尽相同培养基,纵使Ca2+、Mg2+外,别的物质含量不尽相同,以避免出现胚胎休克。活检培养基中直接加入蔗糖有助于细胞皱缩,并且使缩小细胞体积,便于从透明带开孔出取出细胞。活检慢的相当重要,个人建议采取胚胎活检时由另外 名胚胎学工作中人协助各种准备及更换培养皿,以缩短胚胎暴露于培养箱外的时间很长。理想的活检时间很长是我的所有胚胎不不已达 1 min。PGDIS强调生殖四大中心应配备足够的培养箱,以缩短胚胎活检变化变化过程胚胎暴露于培养箱外的时间很长,减轻 开关培养箱次数,避免出现并且使已引起的温度波动。

  胚胎活检中操作多种不同方式者的有关经验对PGD纵使及IVF妊娠结局都它具相当重要已引起影响。PGDIS推荐一 胚胎活检操作多种不同方式者还要它具丰富的有关经验并常规操作多种不同方式该另外技术。PGDIS推荐一 多种不同方式废弃胚胎练习操作多种不同方式,愈来愈减轻 操作多种不同方式核心技能,并强调,不个人建议偶尔操作多种不同方式不少人或有关经验不足不少人采取胚胎活检。生殖四大中心有义务验证活检变化过程而是已引起影响胚胎发育潜能。

  采取卵裂球活检,PGDIS推荐一 活检的胚胎不已达 为5个细胞期不不已达 ,仅能 取1个细胞,避免出现取2个细胞。活检的细胞应完整,并有清晰可见的细胞核。较多文献采取D3胚胎活检纵使已引起影响胚胎发育潜能。目前来看全球全球国内愈来愈多的PGD四大中心采用机械囊胚活检取代卵裂期胚胎活检。

  4、胚胎诊断另外技术指南

  染色体异常的PGD可采取FISH及全基因组扩增直到芯片或测序另外技术诊断。

  4.1 采取FISH的PGD另外技术指南 采取甲酰胺、冰乙酸可减轻 细胞固定直到信号重叠及有关的误诊风险,减轻 细胞核丢失和DNA碎片化。固定变化变化过程细胞浆破裂后不应持续加固定液。杂交前须在相差显微镜下确认并标记细胞核,并检查并胞浆你是否去除干净,如果会已引起影响杂交作用 。细胞固定是依次技巧性强的操作多种不同方式,可多种不同方式D2鼠胚练习细胞固定操作多种不同方式。PGDIS推荐一 PGD前先采取非正常或三体细胞株验证FISH探针。FISH的杂交率应在95%不不已达 。用于检测非整倍体的FISH探针不已达 应另外 X、Y、13、15、16、18、21、22号染色体探针,不少人是为的 是纵使流产胚胎才是常见的三体异常。FISH用于染色体平衡易位肿瘤患者的PGD时,采取的探针应不已达 另外 2个端粒探针和依次着丝粒探针,或2个着丝粒探针和依次端粒探针,依次能检测出所再就 数非平衡染色体组合,别的PGDIS推荐一 PGD前第三点 用携带者的淋巴细胞验证探针作用 后再采取临床检测。

  4.2 采取PCR的PGD另外技术指南 ESHRE PGD顶级控卫推荐一 基因扩增前区域还要是独立于IVF实验室的区域,在层流或层流净化罩下采取扩增前DNA标本再处理。严格遵循PCR实验室规范标准中,还要施行单向工作中流程。因PGD中检测DNA为微量DNA,不少人在既保证独立分区内采取扩增前的标本再处理,再就 数数不永远存在气溶胶污染风险。但应应注意避免出现操作多种不同方式者纵使的外源性DNA污染,不少人扩增前再处理标本时应应注意操作多种不同方式者须穿隔离衣、戴口罩、帽子,以避免出现污染检测标本。所再就 数耗材,另外 吸头、试剂都应无DNA及DNA酶。为避免出现精子综合整理的污染,采取PCR的PGD还要采取卵泡浆内单精子显微注射(ICSI)多种不同方式授精,同理,应尽纵使去除颗粒细胞,以减轻 母源性污染。胚胎活检变化变化过程,不少人 取材变化变化过程细胞破裂,个人建议更换活检针。活检直到细胞在转入PCR反应程度管前应冲洗2遍,以尽纵使少的培养基转入PCR反应程度管。细胞纵使裂解及充分变性是PCR的重要,碱性溶细胞液和蛋白酶K/十二烷基硫酸钠都可采取理想的作用 。

  PGDIS推荐一 第三点 多种不同方式口腔黏膜细胞、淋巴细胞或丢弃、捐赠的囊胚验证单细胞扩增更更有效,不已达 不不已达 质量标准中后再采取临床检测:扩增率不已达 85%;PCR扩增时应别的扩增既定目标基因及既定目标基因邻近的总体高度多态性标记物,依次可检测到扩增失败和ADO;多种不同不同方式态性标记物可检测和避免出现外源性DNA污染,并既保证外源性DNA含量不不已达 5%方可采取临床检验。推荐一 采取巢式或半巢式PCR,或多重荧光PCR。

  PCR用于PGD临床检测时还要设立阴性和阳性对照,阴性对照应另外 直到依次胚胎活检直到培养基。是为减轻 等位基因脱扣(ADO, allele drop-out)风险,ESHRE推荐一 DNA扩增引物部分采用机械中应另外 致病基因,别的致病基因位点别的的、相邻的关于 及不关于 位点,采取总体高度多态性标记物的分析结论,不少人 判断外源性DNA污染及ADO,并且使减轻 单基因病PGD准确率。近年来愈来愈多的四大中心采取连锁分析结论另外技术用于单基因病的PGD,基因连锁分析结论还要自身特点不育夫妇及先证者、是为不育夫妇双亲的DNA分析结论。

  5、纵使判断与出具报告

  另外报告应以书面不同方式出具,联合实验室可采取传真或邮件发送书面报告,细节可采取电话通沟通。报告关于 指出格式固定、纵使清晰、界面友好。PGD报告应另外 不不已达 另外内容:实验室名称及完整信息 ,另外 实验室名称、店铺地址、联系方式电话通等;另外医生完整信息 ;报告日期;报告名称(疾病名称+PGD);检测疾病及基因名称;夫妇姓名及出生日期;标本完整信息 (标本类型、取材日期、收到日期、检测日期);检测不同方式;检测纵使;误诊率;检验者及审核者签名;页码及总页码数。也好FISH或PCR纵使,PGDIS均个人建议由一一位女性性学生它具诊断资质的工作中人依次审阅分析结论,独立出具诊断各种指出,诊断一致时方可出具诊断报告。不少人 一一位女性性学生诊断工作中人判断的纵使不一致,应重复检测,必要时第三次 活检。在而是出具指出诊断报告时,应充分告知肿瘤患者,并由肿瘤患者知情去选择。个人建议在与肿瘤患者关于 PGD纵使前,应由生殖四大中心有资质的推荐专业工作中人认真审查。

  6、遗传咨询与随访

  遗传咨询是PGD的依次重要过程和另外内容。遗传咨询中,生殖四大中心应全面更完美了解肿瘤患者的生育现象会发生会发生,采取其充分的遗传咨询,全面更完美了解肿瘤患者夫妇你来我往遗传病发病现象会发生会发生,绘制家系图谱,必要时第三次 完成与妊娠结局关于 的别的检查并,另外 精液分析结论、染色体、宫腔镜检查并。PGDIS推荐一 生殖四大中心应告知肿瘤患者PGD的变化过程、采不采用机械不同方式、另外技术的局限性及预期纵使。知情同意书中应另外 机构的PGD误诊率,并告知肿瘤患者别的去选择,另外 纵使妊娠后产前诊断的去选择及面临的后果。另外 误诊率综合数据的综合整理应为生殖四大中心上一月 临床综合数据总结,另外 临床会发生的PGD误诊(由产前诊断或产后新生儿基因、染色体诊断证实),别的以未移植的胚胎直到重复分析结论的纵使判断的误诊率。PGDIS推荐一 一 不适宜冷冻及移植的胚胎应用于验证PGD纵使,采取直到对另外卵裂球直到检测分析结论,评估PGD误诊率。系统实现分析结论有助于判断PGD的更更有效,并评估单细胞的误诊率,PGDIS个人建议误诊率应达近10%。

  PGD直到随访是评估PGD更更有效的重要。随访的另外内容另外 着床率、临床妊娠率、临床流产率及新生儿随访,纵使流产胚胎中有少与胎儿染色体异常关于 ,不少人应对流产活动有待分析结论,并且使评估PGD纵使准确性。新生儿随访应更完美了解有无比比较明显或轻微的出生缺陷,以评估胚胎活检纵使对子代的已引起影响,必要时应复查新生儿遗传完整信息 。生殖四大中心和检测四大中心应就PGD直到随访及综合数据收集达成一致。

  PGD妊娠后你是否不少人 采取产前诊断,目前来看全球国内不少生殖四大中心持采取观点,PGDIS也个人建议另外PGD妊娠后肿瘤患者行产前诊断,但PGDIS个人建议应向肿瘤患者人员提供另外可供去选择的产前诊断多种不同方式完整信息 ,另外 绒毛取材、羊水取材、超声诊断及无创产前诊断,如胎儿游离DNA检测。纵使被接受被接受产前诊断的肿瘤患者,应在分娩时抽取脐带血验证染色体、基因纵使,为总结PGD效率人员提供真实更有效的综合数据。

  纵使纵使,指南的目纵使促进PGD四大中心人员提供更这样医疗体验服务,而而是以既保证医疗纵使为是为而制定的。指南而是主要包括操作多种不同不同方式种不同方式或检测,也而是排除纵使再获不尽相同纵使的别的操作多种不同方式或检测。另外医生和实验室另外技术工作中人应可以根据不少人的推荐专业判断来两个决定优先去选择的操作多种不同方式或检测。要应注意指南出版的时间很长,并观注指南颁布直到的文献和科学研究者最新报道。